流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）自70年代發(fā)明之初便匯聚了計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)的智慧，是現(xiàn)代生物學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一，與激光共聚焦和膜片鉗技術(shù)并稱“拉動現(xiàn)代生物科學(xué)研究的三駕馬車”。

       現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)在單克隆抗體制備技術(shù)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)不斷發(fā)展以及流式細(xì)胞儀研制革新的驅(qū)動下，以其高速客觀，能夠處理復(fù)雜樣本并同時獲取多種參數(shù)等諸多優(yōu)點，受到越來越多的生物醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)機構(gòu)的推崇。

 

流式細(xì)胞術(shù)的雛形

 

     “流式細(xì)胞術(shù)”的概念是在1934年被提出來的。那一年Moldavan在《Science》上發(fā)表了一篇文章，首次提出了當(dāng)懸浮的血細(xì)胞流過一個毛細(xì)管時，通過光電傳感器記錄的光信號可以實現(xiàn)“細(xì)胞計數(shù)”的想法。不過第一個將這個想法付諸實施的人卻是Gucker，他在1947年的《Journal of American Chemical Society》上介紹了一個裝置，可用于檢測氣溶膠中的微生物。該裝置通過鞘流將樣本引導(dǎo)到流動室中央，當(dāng)細(xì)胞通過檢測區(qū)時使用光源進(jìn)行照射，然后以光電管接收細(xì)胞產(chǎn)生的光信號。

         Gucker的裝置建成后，科學(xué)家們又開始嘗試將這個技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞計數(shù)上。1953年，Crosland-Taylor在血細(xì)胞計數(shù)儀上使用了類似Gucker裝置的鞘流技術(shù)和光學(xué)系統(tǒng)，第一次完整實現(xiàn)了Moldavan的最初想法。很多產(chǎn)商非?？春眠@種計數(shù)儀，紛紛投入資源開發(fā)類似的分析設(shè)備。至上個世紀(jì)50年代末，相關(guān)方法學(xué)原理和應(yīng)用都已成熟，流式細(xì)胞術(shù)初具雛形。

 

流式細(xì)胞儀的實驗室搭建

 

       20世紀(jì)60年代初，很多科學(xué)家開始嘗試?yán)眉?xì)胞染色和顯微鏡圖像掃描技術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞分類，不過研究過程異常復(fù)雜和艱難。而此時，在IBM工作的Louis Kamentsky卻另辟蹊徑，搭建了一臺流式細(xì)胞儀原理樣機用于白細(xì)胞分類研究，并取名“Rapid Cell Spectrophotometer (RCS)”。這臺流式細(xì)胞儀采用顯微分光光度技術(shù)代替了原始的圖像掃描，采用樣本液流動傳送裝置取代了傳統(tǒng)的顯微鏡平臺，使得過去費時、復(fù)雜的細(xì)胞分類工作變得簡單、高效。1965年Kamentsky在《Science》上發(fā)表了他的研究成果，很多人也因此把他看做是建立流式細(xì)胞儀的第一人。

       Kamentsky的RCS還配備了一個注射泵分選裝置，同樣發(fā)表在1967年的《Science》上，不過遺憾的是，這篇文章卻不是首篇關(guān)于細(xì)胞分選的文章，在Los Alamos Scientific Laboratory的Mack Fulwyler走在了Kamentsky的前面，于1965年率先在《Science》上發(fā)表了第一篇基于Coulter原理和噴墨打印機技術(shù)的細(xì)胞分選的文章，他也因此被認(rèn)為是“液滴分選之父”。
        Kamentsky共搭建了兩臺RCS，其中一臺借給了斯坦福大學(xué)的Leonard Herzenberg。在1969年的《Science》上， Herzenberg第一次發(fā)表了利用熒光染色技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行分選的方法。在隨后的幾年，Herzenberg又在RCS基礎(chǔ)上對流式細(xì)胞儀進(jìn)行了改進(jìn)，搭建了用熒光觸發(fā)的流式細(xì)胞分選儀（Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS），并建立了將FACS與熒光單克隆抗體結(jié)合檢測細(xì)胞的技術(shù)。從此，流式細(xì)胞儀開始進(jìn)入“熒光染色時代”。

 

區(qū)別一組概念：隨著時代的發(fā)展，F(xiàn)CM（流式細(xì)胞術(shù)）與FACS（熒光激發(fā)細(xì)胞分選實驗）所指代的具體實驗技術(shù)各有側(cè)重。

 

商品化流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)

 

       盡管沒有像Kamentsky、Fulwyler和Herzenberg那樣在《Science》上發(fā)表過類似的“傳世佳作”， 德國科學(xué)家Wolfgang Göhde卻因1969年研制了世界上第一臺商品化的熒光流式細(xì)胞儀“Impulscytophotometer”（ICP-11）而“名留千古”。
       Kamentsky離開IBM后創(chuàng)建了一家公司Bio/Physics Systems，并于1970年推出了流式細(xì)胞儀Cytograf和Cytofluorograf。1972年在斯坦福大學(xué)，Herzenberg開發(fā)出FACS后，又與Becton-Dickinson（BD）公司合作，于1974年推出了BD的第一款商用流式細(xì)胞儀FACS-1。同期，F(xiàn)ulwyler也離開了他所工作的實驗室，加盟到Coulter公司旗下的Particle Technologies繼續(xù)研究流式細(xì)胞儀，后來在他和Robert Auer的帶領(lǐng)下Coulter公司也在1975年推出了自己的第一款商用產(chǎn)品TPS-1。

FACS-1與Herzenberg

 

從科研到臨床

 

      隨著單克隆抗體制備技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的血細(xì)胞分化決定簇（cluster of differentiation, CD）被發(fā)現(xiàn)。在研究這些CD在細(xì)胞分化和調(diào)控機制中的作用時，流式細(xì)胞儀起到了重要作用，從而促成了相關(guān)科研成果向醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速轉(zhuǎn)化。
      CD4細(xì)胞計數(shù)就是一個利用流式細(xì)胞儀把科研轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用過程中具有代表性的例子。結(jié)合流式細(xì)胞儀和單克隆抗體，可以將T淋巴細(xì)胞劃分為CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞，而前者是人體免疫系統(tǒng)的“司令官”，指導(dǎo)著其它免疫細(xì)胞對抗病原微生物的侵襲。在AIDS發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn)，HIV入侵的靶細(xì)胞主要是CD4細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞后會大量繁殖，直接溶解、破壞CD4細(xì)胞，致使AIDS患者常常表現(xiàn)為CD4細(xì)胞降低，因而CD4細(xì)胞計數(shù)成為了AIDS的診斷依據(jù)。CD4細(xì)胞在HIV/AIDS中重要作用的發(fā)現(xiàn)，使過去僅在科研中使用的流式細(xì)胞儀開始走入醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，并成為臨床上檢測CD4細(xì)胞的主要方法。
       科研人員用流式細(xì)胞儀在CD4細(xì)胞的研究和應(yīng)用為臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用打開了一扇窗，為人們展示了流式細(xì)胞儀的重要作用，也為臨床醫(yī)學(xué)帶來了巨大的變化。目前，通過流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞亞群（例如T、B、NK細(xì)胞）分析已成為臨床上評估免疫功能的主要方法，在免疫缺陷病、移植排斥反應(yīng)、感染性疾病、自身免疫病、腫瘤、間質(zhì)性肺疾病等的診斷、治療和療效預(yù)測中都發(fā)揮著越來越重要的作用；以流式免疫分型為主體的MICM分型方法取代了以形態(tài)學(xué)為依據(jù)的FAB分型，使白血病分型更趨細(xì)致和精確；流式CD34細(xì)胞計數(shù)法取代了體外集落形成單位計數(shù)法，為評估干細(xì)胞采集效果提供了簡單、快速的方法；通過流式細(xì)胞儀研究Th1/Th2、Treg、Th17等重要免疫細(xì)胞，為闡明某些疾病的發(fā)病機制提供更多證據(jù)。隨著時間的推移，流式細(xì)胞儀將在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色。

 

從單色向多色

 

       早期，流式細(xì)胞儀在科研中的主要應(yīng)用是DNA含量測定，這種技術(shù)要求不高，配備一個散射光和一個熒光通道的流式細(xì)胞儀就可以完成檢測。不過1975年Köhler和Milstein建立單克隆抗體制備技術(shù)之后，越來越多新抗體和熒光染料被發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們可以同時使用多個熒光標(biāo)記抗體來研究細(xì)胞，因此對多激光、多熒光流式細(xì)胞儀的需求越來越大。
      多色流式細(xì)胞儀可以同時收集更多的細(xì)胞信息，意味著在得到相同的參數(shù)和信息的情況下，可以減少樣本測試的次數(shù)。上世紀(jì)80年代，在使用雙色（熒光）流式細(xì)胞儀時，要完成淋巴細(xì)胞亞群（T、B、NK細(xì)胞）的鑒別需要6次測試。但隨著4~6色流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)，只需1~2次測試就可完成。當(dāng)然熒光數(shù)量也并非越多越好，太多的熒光信號除了增加儀器成本外，它們之間還會相互“滲漏”，使熒光補償變得異常復(fù)雜和繁瑣，甚至可能導(dǎo)致補償錯誤而影響檢測結(jié)果。

 

從相對到絕對

 

      由于技術(shù)原理上的限制，早期的流式細(xì)胞儀只能進(jìn)行被測細(xì)胞的百分比測試，卻無法直接輸出細(xì)胞的絕對濃度（單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，又稱絕對計數(shù)）。隨著臨床研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)某些被測細(xì)胞的濃度對于臨床診斷和治療具有非常重要的意義。例如，WHO就建議以“ CD4+細(xì)胞小于500個/μL ”作為啟動抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的重要依據(jù)。
       為了解決絕對計數(shù)的問題，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀主要使用雙平臺法和微球法。雙平臺法分別從血細(xì)胞分析儀和流式細(xì)胞儀獲得相關(guān)細(xì)胞的絕對值和百分比，再通過二者的乘積得出被測細(xì)胞的絕對計數(shù)值。由于該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異系數(shù)大，不同實驗室之間的差異也較大，因此已逐漸被其它方法所取代。微球法則是把被測樣本加入到具有已知數(shù)量微球的試管中，然后通過被測細(xì)胞和微球的比例關(guān)系來進(jìn)行絕對計數(shù)。由于計數(shù)微球價格較為昂貴，測試成本過高，這種方法一直未被臨床廣泛采用。

 

從傳統(tǒng)到質(zhì)譜

 

       隨著多激光多色流式細(xì)胞儀的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)熒光素發(fā)光光譜間的泄漏和補償成為多色流式細(xì)胞分析儀應(yīng)用的一個約束。質(zhì)譜流式細(xì)胞儀是在通過流式細(xì)胞分析的過程中結(jié)合了質(zhì)譜儀的測量方法，采用金屬元素標(biāo)記物偶聯(lián)特異性抗體，然后利用流式細(xì)胞術(shù)原理分離單個細(xì)胞，再使用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）測量單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部抗原分子的數(shù)據(jù)。

       與傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)相比，金屬元素同位素質(zhì)譜峰非常窄小，利用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)完全可以克服熒光素發(fā)光光譜的相互泄漏問題，即使幾十個甚至上百個測試通道也互不干擾，這在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀上是無法想象的。

2018年諾貝爾獲得者James P.Allison和Fludigm公司的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀Helios

       CyTOF平臺最初由DVS Sciences公司開發(fā)，后被Fluidigm公司收購。儀器采用同位素標(biāo)記抗體來標(biāo)記或識別細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子，并根據(jù)流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞，再用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）觀察單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)。

 

內(nèi)容摘選自邁瑞流式