熒光膜片鉗技術(shù)的發(fā)展

       2000年，Zheng與Zagotta共同努力，一種新的結(jié)合熒光記錄和內(nèi)面向外膜片鉗模式的熒光膜片鉗(PCF)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)最初設(shè)計(jì)解決環(huán)核苷酸門控(CNG)通道蛋白與cGMP結(jié)合所產(chǎn)生的化學(xué)能如何驅(qū)動(dòng)通道被激活的問(wèn)題.首次報(bào)道的熒光膜片鉗研究中，將馬來(lái)酰亞胺用Alexa Fluor488熒光標(biāo)記后，觀察其修飾CNG通道蛋白上的半胱氨酸(胞內(nèi)C端環(huán)核苷酸結(jié)合域的C481位點(diǎn))的作用，通過(guò)記錄熒光信號(hào)判斷修飾所引發(fā)的通道蛋白結(jié)構(gòu)變化，從而影響cGMP與CNG通道蛋白結(jié)合以及通道的激活.實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用一根開(kāi)口大約為幾微米的拋光玻璃電極，封接表達(dá)于包含半胱氨酸的離子通道蛋白的細(xì)胞膜表面，通過(guò)拉回玻璃電極使細(xì)胞表面撕下的一小塊細(xì)胞膜附著于玻璃電極尖部，熒光團(tuán)標(biāo)記和記錄都在這一平方微米尺度的細(xì)胞膜片上進(jìn)行.熒光膜片鉗允許在通道蛋白的胞內(nèi)及胞外兩側(cè)記錄熒光信號(hào).由于熒光信號(hào)記錄的是從一小片游離膜上包含的離子通道信息，由胞內(nèi)組分所產(chǎn)生的自發(fā)熒光造成的污染被除去.這使得熒光信號(hào)的信噪比增加，從而得到更高的分辨率.當(dāng)結(jié)合高度敏感性、低噪聲的熒光探測(cè)器，熒光膜片鉗可以記錄到單獨(dú)一個(gè)蛋白質(zhì)分子，實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時(shí)記錄.

       基于內(nèi)面向外的熒光膜片鉗被稱為經(jīng)典熒光膜片鉗，而后不同的研究小組也陸續(xù)報(bào)道了全細(xì)胞模式、細(xì)胞貼附模式的熒光膜片鉗，作為熒光膜片鉗技術(shù)的擴(kuò)展.Yang等將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用到HEK全細(xì)胞模式下溫度敏感TRP離子通道的溫度激活的實(shí)驗(yàn)研究中，采用全細(xì)胞模式，同時(shí)記錄通道電流和熒光信號(hào)，使得熒光膜片鉗最初的大部分優(yōu)勢(shì)得以保留，在電流發(fā)生階段，全細(xì)胞熒光膜片鉗只記錄胞外標(biāo)定的熒光團(tuán).到目前為止，熒光膜片鉗被應(yīng)用于CNG通道門控及構(gòu)象變化關(guān)系,CNG通道蛋白亞基配比、HCN通道在超極化激活下配體結(jié)合和門控間的關(guān)系研究.Mony等應(yīng)用熒光膜片鉗結(jié)合熒光電壓鉗，對(duì)質(zhì)子通道Hv1的門控研究揭示了通道激活過(guò)程中S1和S4的結(jié)構(gòu)重排，指出兩部分在通道活動(dòng)中既相互獨(dú)立又相互影響的特性.最近Nomura等將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌源的機(jī)械刺激敏感通道在人工構(gòu)建的脂質(zhì)膜中重組的方向特性研究.毫無(wú)疑問(wèn)，膜片鉗的多種鉗制模式使開(kāi)發(fā)熒光膜片鉗新方法具有了許多優(yōu)勢(shì).

熒光膜片鉗技術(shù)優(yōu)勢(shì)

       熒光膜片鉗技術(shù)對(duì)胞膜上離子通道的特異位點(diǎn)采用熒光標(biāo)記，研究者可以直接觀察發(fā)生在特定通道結(jié)構(gòu)上的實(shí)時(shí)構(gòu)象重排.半胱氨酸通過(guò)基因突變技術(shù)被引入到通道蛋白的興趣位點(diǎn)，如果必要，通道蛋白上原有的半胱氨酸可以通過(guò)基因突變被全部替換以確保所有記錄信號(hào)的特異性.半胱氨酸殘基作為與巰基特異反應(yīng)的熒光團(tuán)的定位點(diǎn)，允許特異位點(diǎn)熒光團(tuán)標(biāo)定.電流和熒光信號(hào)被同時(shí)從同一組離子通道蛋白記錄，這是熒光膜片鉗與熒光電壓鉗的主要區(qū)別之一.電流信號(hào)，作為通道開(kāi)放和離子流動(dòng)的結(jié)果，可做為通道功能的指示器.當(dāng)半胱氨酸附近的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重排影響到熒光團(tuán)的量子產(chǎn)出、遷移率、與鄰近的熒光團(tuán)的距離變化等因素時(shí)，熒光發(fā)射也發(fā)生改變.這樣，熒光團(tuán)可作為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的高度敏感的報(bào)告基團(tuán).因?yàn)闊晒庑盘?hào)不像離子電流信號(hào)那樣依賴于離子通道孔區(qū)的開(kāi)放，熒光記錄為探究離子通道蛋白到達(dá)開(kāi)放狀態(tài)前的構(gòu)象變化的時(shí)空信息提供了一個(gè)新的手段.熒光膜片鉗作為一種全新的研究正常功能下通道蛋白分子活動(dòng)的方法，可以廣泛應(yīng)用于任何通道類型，甚至可以嘗試非通道的膜蛋白，如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體蛋白等.研究也表明，熒光記錄也可以成為高通量藥物篩選中電流記錄的有效替代.

      與直徑1 mm的卵母細(xì)胞相比，分離的膜片要小得多.那么為什么還能得到足夠強(qiáng)的熒光信號(hào)呢？這其中的原因主要有兩個(gè).第一，在HEK細(xì)胞膜上可以高密度地表達(dá)通道蛋白，對(duì)許多離子通道而言，從一片分離的細(xì)胞膜上可以得到幾百到幾千個(gè)通道分子，因?yàn)槊舾械墓鈱W(xué)探測(cè)器(如CCD相機(jī))可以觀察單個(gè)熒光分子，成百上千個(gè)熒光分子所發(fā)出的熒光在檢測(cè)上自然沒(méi)有問(wèn)題.第二，因?yàn)槟て苄。@樣就可以使用高采光效率的光學(xué)鏡頭(如40倍數(shù)值孔徑NA值大于1.4的高分辨物鏡)采集整個(gè)膜片上所有的熒光信號(hào).與之相比，卵母細(xì)胞雖然很大，但大多數(shù)熒光都沒(méi)有被收集到.

       熒光膜片鉗記錄提供了優(yōu)越的敏感性和時(shí)間分辨率，而且同熒光電壓鉗記錄相比，熒光膜片鉗可以直接控制胞內(nèi)環(huán)境，優(yōu)勢(shì)如下：第一，可以面對(duì)離子通道胞內(nèi)一側(cè)并對(duì)相關(guān)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)定；第二，排除了由胞內(nèi)環(huán)境所造成的自發(fā)熒光，熒光探測(cè)敏感性大為提高；第三，可以施加胞內(nèi)配體及通道調(diào)節(jié)分子來(lái)調(diào)節(jié)通道的門控；第四，電流記錄具有更高的時(shí)間分辨率。

轉(zhuǎn)自程為等生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展：熒光膜片鉗新技術(shù)的應(yīng)用及進(jìn)展