為什么要進(jìn)行封閉?

在免疫測定中必須封閉自由表面。這對于很多方法如ELISA、protein arrays、immuno-PCR、Western blotting 或免疫組織化學(xué)都是正確的做法。

ELISA板或Western blotting膜的表面經(jīng)過優(yōu)化后，可有效地附著蛋白質(zhì)或抗體。這樣可以在表面以高密度的捕獲抗體或捕獲分子進(jìn)行最佳分析。

這種優(yōu)化的結(jié)果是，許多其他的蛋白或多肽都能附著在表面上。這種附著是可逆的。在不封閉表面的情況下，樣本中的分析抗體、示蹤劑、分析物或其他成分都會結(jié)合到表面上。這可能會導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果或高背景信號。即使不存在分析物，檢測抗體直接連接到ELISA板孔也會產(chǎn)生信號。必須阻止這種情況發(fā)生。為了使各個(gè)表面的自由結(jié)合能力飽和，必須進(jìn)行封閉。通過用致密的分子層覆蓋表面而使該層沒有間隙，從而實(shí)現(xiàn)飽和。

怎樣進(jìn)行封閉?

用捕獲抗體（或抗原）包被ELISA 板后，必須封閉表面的自由結(jié)合位點(diǎn)。 封閉溶液中含有高濃度的封閉劑。在微孔中進(jìn)行孵育。這導(dǎo)致封閉劑吸附到表面上的自由結(jié)合位點(diǎn)。 理想地，產(chǎn)生完全致密且無間隙的層。 孵育時(shí)間取決于封閉劑，并且可能非常短（如果使用非常好的封閉劑）。 通常，建議使用更長的孵育時(shí)間并選擇適當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E。 孵化時(shí)間通常為1-2小時(shí)或過夜。

封閉后可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)測定。除了封閉步驟外，建議隨后使用Liquid Plate Sealer® 進(jìn)行封閉后板的穩(wěn)定。這可以提高捕獲抗體與分析物的結(jié)合能力，并且可以在靈敏度和可重復(fù)性方面改善某些測定的結(jié)果。 此外，可以將未使用的包被ELISA板保存更長的時(shí)間。該穩(wěn)定劑與封閉劑一起在ELISA板的孔中孵育。Liquid Plate Sealer®用易于溶解的保護(hù)層覆蓋捕獲的抗體或包被的抗原。

該層有兩個(gè)作用。首先，該層可以直接改善許多捕獲抗體或抗原的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。構(gòu)象的改善發(fā)生在孵育以及后續(xù)的ELISA板的干燥過程中。與未處理的捕獲抗體相比，此時(shí)的捕獲抗體具有更高的結(jié)合能力。當(dāng)ELISA板干燥后，該效應(yīng)與包被的捕獲分子有關(guān)，可以直接測量該效應(yīng)。第二個(gè)作用是包被生物分子的長期穩(wěn)定。穩(wěn)定后，ELISA 板可在4°C下長時(shí)間保存。在大多數(shù)情況下，可以通過涂覆和存儲許多板來簡化實(shí)驗(yàn)室的操作程序。穩(wěn)定化也可用于降低ELISA變異的效率。 Liquid Plate Sealer®的積極作用在很大程度上取決于所使用的生物材料（如抗體和抗原）。因此，通常不能基于單獨(dú)的測定來定量陽性效果。

存在最完美的封閉劑嗎?

沒有完美的封閉劑可以適用于各種測定。封閉劑必須與相應(yīng)的檢測方法匹配，并且必須針對任何新的檢測方法進(jìn)行單獨(dú)選擇。對于優(yōu)化的用于蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合的板和western blotting膜，基于蛋白質(zhì)的封閉劑比其他封閉劑更有效。在大多數(shù)情況下，合成封閉劑的效率要比基于蛋白質(zhì)或多肽的封閉劑低。

經(jīng)典選擇: 用BSA進(jìn)行封閉

BSA-Block是基于BSA（牛血清白蛋白）的經(jīng)典封閉劑。 BSA是最重要的蛋白質(zhì)之一，可以以良好的純度和適量的量用于研究應(yīng)用。因此，它很早就被用作免疫測定中的封閉劑。它在使用過的許多測定方法中都有可靠的驗(yàn)證記錄。產(chǎn)品BSA-Block是在經(jīng)過認(rèn)證的公司從純化的BSA生產(chǎn)出來的。與所有基于BSA的溶液一樣，封閉效果也不是最佳的。 BSA是一種蛋白質(zhì)，它太大了，無法建立具有最佳密度的層。但是對于大多數(shù)測定來說，這是可以接受的，對于某些測定，BSA是最佳的封閉劑。有些抗體只有在BSA 存在時(shí)才顯示最佳結(jié)合效率。某些抗體，作為包被抗體進(jìn)行包被，之后用BSA封閉后可顯示最佳結(jié)果。對于某些抗體，BSA-Block將顯示出比任何其他封閉劑更好的測定結(jié)果，因?yàn)閷Σ东@抗體具有直接的積極作用。結(jié)合隨后使用Liquid Plate Sealer®作為包被抗體的穩(wěn)定劑進(jìn)行孵育，可以顯著改善BSA對抗體的積極作用。與合成封閉劑相比，BSA的封閉效果極佳，但低于新型封閉的效果。

最高性價(jià)比的封閉劑

許多檢測方法的開發(fā)是為了獲得良好的產(chǎn)品性能、可重復(fù)性和經(jīng)濟(jì)性。對于此類檢測，CANDOR已開發(fā)出基于肽的封閉劑SmartBlock™。其批間一致性與合成封閉劑的高一致性相當(dāng)。SmartBlock™作為一種基于肽的封閉劑，可以在表面上很好地結(jié)合，也可以結(jié)合抗體或蛋白質(zhì)。 另外，肽的化學(xué)優(yōu)化增強(qiáng)了蛋白質(zhì)結(jié)合表面上的結(jié)合。 因此，與許多其他封閉劑相比，其封閉效果更佳。盡管如此，它還是一款經(jīng)濟(jì)型產(chǎn)品，也可以用于Western blotting和ELISA試劑盒的生產(chǎn)。 對于免疫研究測定和應(yīng)用，SmartBlock™是最高效的封閉劑。

最有效的封閉劑

多年來，酪蛋白在文獻(xiàn)中已被描述為一種合適的封閉蛋白。酪蛋白的封閉效率通常優(yōu)于BSA。酪蛋白提供了許多可商購的封閉劑。在生產(chǎn)過程中，通常會溶解并過濾酪蛋白以去除未溶解的成分。 CANDOR提供基于酪蛋白的封閉劑——The Blocking Solution。但是， 該封閉劑無法與其他廠家提供的常規(guī)酪蛋白封閉劑相提并論。高度純化的酪蛋白在CANDOR開發(fā)的專有生產(chǎn)工藝中進(jìn)行了化學(xué)修飾。在生產(chǎn)過程中，修飾的酪蛋白被片段化。結(jié)果是得到了一種光譜范圍廣泛且一致的不同大小片段的經(jīng)修飾的酪蛋白溶液。盡管生產(chǎn)過程很困難，但批間一致性仍然非常好。每批The Blocking Solution在測定中都提供了相同的結(jié)果。從而被允許在GLP實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)具有極低檢測限的現(xiàn)代診斷中常規(guī)使用， 如現(xiàn)代生物標(biāo)志物的診斷。獨(dú)特的生產(chǎn)工藝帶來極為有效的特色封閉劑。

與替代封閉劑如BSA相比，這款試劑極高的封閉效果可通過測量變異系數(shù)（cv）來輕松量化。通常，并非每種測定中都需要The Blocking S olution的極高功效。我們建議將The Blockin g Solution用于需要精確、可靠和可重現(xiàn)分析物定量分析的關(guān)鍵應(yīng)用中，以及用于稀有和珍貴樣本的分析。

哪種類型的封閉劑是不建議使用的?

我們建議您不要使用批次與批次之間成分差異很大或可能被污染的封閉劑。使用此類封閉劑，您可以觀察到變化的結(jié)果或取決于批次的不同背景。此類封閉劑的使用不適用于GLP實(shí)驗(yàn)室等規(guī)范區(qū)域或人診斷試劑盒的生產(chǎn)。在這些區(qū)域中，不允許更改純度， 這將意味著需要對每批產(chǎn)品進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證。

這些不當(dāng)?shù)姆忾]劑包括基于奶粉的封閉劑和一些可商購的阻滯劑，例如基于魚提取物和許多其他基于動物的提取物。 對于奶粉，應(yīng)該提到的是，奶粉僅是食物，而不是用于實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)藥品。 奶粉可能是最便宜的封閉劑，但僅在污染引起的可變或不清楚的結(jié)果不是很關(guān)鍵的情況下才應(yīng)使用。奶粉作為一種便宜的封閉劑應(yīng)合理應(yīng)用，在某些研究領(lǐng)域中用于測定，也可用于如大學(xué)里的教學(xué)實(shí)驗(yàn)用途。

為了獲得可靠的結(jié)果，應(yīng)避免使用奶粉或未純化的封閉提取物。 如果材料的來源是標(biāo)準(zhǔn)化來源，并且采用標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)和純化方法，則基于魚（或其他動物）提取物的封閉劑可能是合適的。 但這是理論上的觀點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)供應(yīng)商不保證標(biāo)準(zhǔn)化的來源、 純化過程和良好的批間一致性。 因此很難在市場上找到這種封閉劑。

總之，有必要為每種檢測方法尋找并找到合適的封閉劑。 在選擇合適的封閉劑之前，必須明確測定質(zhì)量或結(jié)果質(zhì)量的重要性。 如果是珍貴的樣本或需要可靠的結(jié)果（例如法規(guī)要求），則必須注意高封閉效率。 如果對結(jié)果質(zhì)量的要求較低，也可以使用簡單的封閉劑。如大學(xué)或高校里的教學(xué)和培訓(xùn)的分析，用奶粉處理則沒有任何問題。